iPS人誘導多能細胞

規(guī)格：1×10⁶ cells/管

活細胞運輸：收到細胞后，請立即放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

凍存細胞運輸：可暫存于-80℃冰箱或液氮長期儲存。

產(chǎn)品簡介： 

iPS人誘導多能細胞產(chǎn)品是利用病毒載體將四因子系統(tǒng)(Oct4、Sox2、 Klf4 、c-Myc)轉(zhuǎn)入皮膚成纖維細胞（成年女性）將其誘導重編程為iPS細胞，且對iPS細胞進行分化及干細胞marker鑒定。該產(chǎn)品采用埃澤思生物的人多能干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000/AC-1001001）進行細胞培養(yǎng)與傳代。本產(chǎn)品經(jīng)檢測人iPS細胞無細菌、真菌、霉菌、支原體污染。

產(chǎn)品組成：

實驗材料

H1人胚胎干細胞系（Applied Cell^?: Cat. no.AC-2001002）

H9人胚胎干細胞系（Applied Cell^?: Cat. no.AC-2001003）

人多能干細胞培養(yǎng)基（Applied Cell^?: Cat. no. AC-1001000）

Advance人多能干細胞培養(yǎng)基（Applied Cell^?: Cat. no. AC-1001001）

即用型基質(zhì)膠（Applied Cell^?: Cat. no.AC-1001007）

人多能干細胞消化液（Applied Cell^?: Cat. no.AC-1001008）

Serum-Free干細胞凍存液（Applied Cell^?: Cat. no.AC-1001012）

磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline，PBS)

操作方法（以下步驟皆應在無菌條件下操作）

iPS人誘導多能干細胞復蘇操作：

1. 實驗操作步驟：

1.1  基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲存，并于1周內(nèi)使用。

注意：①一支凍存的干細胞的數(shù)量在1×10⁶cells/mL左右，對應6孔板1孔；②即用型基質(zhì)膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2  先將2~3mL的干細胞培養(yǎng)基加入15mL離心管中備用。

1.3  解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1~2min內(nèi)快速解凍；

注意：細胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

1.4  離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細胞培養(yǎng)基的15mL離心管中，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000rpm離心3min；

1.5  重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細胞培養(yǎng)基對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

1.6  接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細胞懸液加入到已經(jīng)包被好的6孔板中，并補全每孔2mL培養(yǎng)體系。

1.7  培養(yǎng)：接種后的6孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細胞密度以及細胞團塊大小，呈4個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細胞均勻分布。并置于37℃，5% CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細胞貼壁情況；

1.8  換液：從復蘇的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應及時更換新鮮培養(yǎng)基。

iPS人誘導多能干細胞傳代

2.  實驗具體操作步驟：

2.1 清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入1 mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；

2.2  消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干細胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于37℃培養(yǎng)箱中2~5 min；

注意：消化時間依據(jù)干細胞生長密度，消化時間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗一般建議時間2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3  吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干細胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打3~5次，使皿底干細胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

2.4  離心：1000rpm離心3min；

2.5  接種：棄上清，用干細胞培養(yǎng)基吹打細胞5-10次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補全每孔2mL的培養(yǎng)體系。

注意：吹打細胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過10次，并且

2.6  換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應及時更換新鮮培養(yǎng)基。

iPS人誘導多能干細胞凍存

3. 實驗具體操作步驟：

3.1  清洗：同2.1；

3.2  消化：同2.2；

3.3  吹打：同2.3；

3.4  離心：同2.4；

3.5  重懸：離心后棄上清，加入2 mL Serum-Free干細胞凍存液（AC- 1001012）對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5次后，將其加入到凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時放回4℃冰箱。

3.6  記錄：在凍存管上標記凍存細胞種類、時間、操作者及細胞批次。

3.7  -80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。

 注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8  液氮凍存：24小時后將-80℃冰箱中的細胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存。

 圖1 人iPS細胞細胞形態(tài)圖 100×                                                       圖2 人iPS細胞熒光染色圖 200×  

質(zhì)檢控制