1.原核表達(dá)概念
蛋白表達(dá)是指用模式生物如細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或者植物細(xì)胞表達(dá)外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。原核蛋白表達(dá)是指通過(guò)基因克隆技術(shù)，將外源目的基因，通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體并導(dǎo)入表達(dá)菌株的方法，使其在特定原核生物或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
2.原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)
常見(jiàn)的蛋白表達(dá)系統(tǒng)有原核、酵母、昆蟲(chóng)、植物和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其中最經(jīng)濟(jì)最實(shí)惠的是原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，四種常見(jiàn)表達(dá)系統(tǒng)區(qū)別如下表1：
表1：常見(jiàn)蛋白表達(dá)系統(tǒng)區(qū)別
表達(dá)系統(tǒng) | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
原核 | 經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，表達(dá)量高 | 不能進(jìn)行糖基化修飾，形成包涵體；產(chǎn)生內(nèi)毒素 |
酵母 | 表達(dá)量高，有翻譯后修飾功能，可大規(guī)模表達(dá) | 缺乏強(qiáng)有力的受?chē)?yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子，分泌效率低 |
哺乳動(dòng)物 | 產(chǎn)品的抗原性、免疫源性與天然蛋白最接近，糖基化準(zhǔn)確 | 產(chǎn)量低 |
昆蟲(chóng) | 糖基化形式較低，表達(dá)形式單一 | 成本高，表達(dá)量低 |
植物 | 易于大規(guī)模培養(yǎng) | 轉(zhuǎn)基因植物費(fèi)用高，表達(dá)量難提高，分離純化不便 |
蛋白表達(dá)量：原核＞酵母＞哺乳，昆蟲(chóng)系統(tǒng)與原核和酵母接近，選擇合適的蛋白表達(dá)系統(tǒng)還需要根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)成本、周期等一系列因素綜合考量，目前最常用的是原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)體系常用的宿主為大腸桿菌和枯草桿菌，前者表達(dá)量高，后期產(chǎn)品需要去除內(nèi)毒素；后者蛋白產(chǎn)量相對(duì)較低，但不產(chǎn)生內(nèi)毒素。
3.原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)組成
一個(gè)完整的蛋白表達(dá)系統(tǒng)通常包括宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。
3.1宿主菌
原核蛋白常見(jiàn)宿主菌系列為BL21（DE3）、Rosetta系列菌株。
3.2外源基因
由于外源基因具有多樣性，高效表達(dá)外源基因須考慮優(yōu)化密碼子，提高外源基因 mRNA 的穩(wěn)定性，優(yōu)化載體設(shè)計(jì)等。
3.3表達(dá)載體
原核蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒包括復(fù)制子(Replicon)、啟動(dòng)子(promoter)、篩選標(biāo)簽(selection marker)、多克隆位點(diǎn)（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy)，常見(jiàn)的原核表達(dá)載體pET-28a（+）、pGEX-4T-1、pET SUMO。
3.4其他組成（融合標(biāo)簽）
蛋白重組表達(dá)過(guò)程中采用親和標(biāo)簽融合表達(dá)有兩方面的作用：一方面是為了使蛋白純化過(guò)程變得更加容易；另一方面是為了促進(jìn)某些不溶性蛋白可溶。融合標(biāo)簽選擇可參考卡梅德官網(wǎng)列表。
4.原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用方向
原核表達(dá)系統(tǒng)有非常良好的應(yīng)用前景。根據(jù)查詢(xún)相關(guān)公開(kāi)信息顯示，原核表達(dá)系統(tǒng)可以用于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白，如藥物、疫苗、抗體等（如CMD-RP00002），從而為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了有力的支持，原核表達(dá)系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)植物和動(dòng)物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗菌肽、抗蟲(chóng)蛋白等，從而提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，降低農(nóng)藥使用量，保障食品安全。同時(shí)，原核表達(dá)系統(tǒng)也可以用于生產(chǎn)工業(yè)酶、生物染料等，具有高效、低成本、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，為工業(yè)生產(chǎn)提供了新的途徑。
5.卡梅德生物提供原核蛋白表達(dá)服務(wù)
卡梅德生物致力于為客戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)的原核蛋白表達(dá)服務(wù)，每年提供多達(dá)400個(gè)原核蛋白制備項(xiàng)目。卡梅德生物（KMD Bioscience）設(shè)計(jì)了一套有效的包含多種融合標(biāo)簽（His，GST，SUMO，FLAG等標(biāo)簽）的表達(dá)載體，能夠?yàn)榭蛻?hù)可溶性表達(dá)超過(guò)150kDa分子量的重組蛋白；同時(shí)我們收集與建立了多種表達(dá)菌株（包括低溫誘導(dǎo)表達(dá)菌株，10-16℃超低溫誘導(dǎo)表達(dá)蛋白），以保證每一個(gè)重組蛋白制備的品質(zhì)。
6.卡梅德生物為客戶(hù)提供原核蛋白表達(dá)全流程介紹
6.1優(yōu)化密碼子
大腸桿菌對(duì)密碼子的使用頻率不同，有最佳密碼子，偏好密碼子，一般選擇使用頻率大于20%的密碼子?；蛐蛄薪?jīng)過(guò)優(yōu)化，能提高mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，避免tRNA庫(kù)數(shù)量不充足延遲/終止翻譯，翻譯移碼和氨基酸錯(cuò)配等情況。
6.2目的基因合成
通過(guò)PCR方法，以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
6.3表達(dá)載體構(gòu)建
選擇合適的載體，常見(jiàn)原核表達(dá)載體是pET系列、pGEX-4T-1、pET-SUMO等，將表達(dá)質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳，PCR產(chǎn)物雙酶切后回收。
6.4轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株
原核蛋白使用BL21（DE3）、Rosetta系列菌株，將質(zhì)粒載體在連接酶作用下轉(zhuǎn)化到RosseStta BL21菌株，通過(guò)涂布TB（含50ug/ml kana）平板篩選，挑取單克隆進(jìn)行活化培養(yǎng)。
6.5蛋白表達(dá)鑒定
從TB平板中挑取單克隆活化培養(yǎng)至菌體OD600為0.6-0.8時(shí)，IPTG進(jìn)行37℃誘導(dǎo)4h表達(dá)，取誘導(dǎo)表達(dá)前與誘導(dǎo)后各條件的菌體制樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。
6.6蛋白放大表達(dá)與純化
6.6.1放大表達(dá)
取能夠表達(dá)目的蛋白的BL21菌株，接種到1L TB培養(yǎng)基，加入IPTG誘導(dǎo)12h，離心，收集菌泥，超聲破碎后收集上清和沉淀，如下圖放大誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果：
6.6.2純化
上清純化：過(guò)濾膜上Ni柱親和富集純化，SDS-PAGE分析。
包涵體（沉淀）純化：緩沖液洗脫上Ni柱親和富集純化，SDS-PAGE分析，純化結(jié)果如下圖：
6.7交付
卡梅德生物交付完整的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)告和測(cè)定出濃度的蛋白，以及SDS-PAGE結(jié)果圖片。
經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，卡梅德生物科技(KMD Bioscience)建立了一套完整的蛋白表達(dá)，蛋白發(fā)酵，蛋白小試與中試規(guī)模的工藝技術(shù)支持。蛋白體外重組表達(dá)與制備，通常涉及到表達(dá)宿主的選擇，基因的合成，載體的構(gòu)建等技術(shù)細(xì)節(jié)。客戶(hù)只需要提供我們一段蛋白序列，CDS或蛋白名稱(chēng)，我們富有經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)家均可以為您在較短的時(shí)間內(nèi)制定一個(gè)完整的蛋白表達(dá)和純化方案。