人類多能干細(xì)胞(hPSCs)因其擁有分化為機體所有類型細(xì)胞的能力，使得hPSCs成為研究發(fā)育機制以及疾病機理最常用的工具，同時在再生醫(yī)學(xué)以及疾病治療領(lǐng)域也有非常廣泛應(yīng)用。人類多能干細(xì)胞因其來源不同又可分為胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）。

      小鼠胚胎干細(xì)胞由Martin Evans在1970年首次從小鼠胚囊中分離獲得，小鼠胚胎干細(xì)胞就可以成功地在體外進(jìn)行培養(yǎng)。人的胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)在1998年由美國科學(xué)家James Thomson培養(yǎng)成功。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是日本科學(xué)家山中伸彌（Shinay Yamanaka）團(tuán)隊在2006年利用病毒載體將Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc四個轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程而成。iPS細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、基因蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾以及畸胎瘤形成能力與胚胎干細(xì)胞非常相似。2007年11月，山中伸彌實驗室成功將人類皮膚纖維母細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞。2009年我國科學(xué)家周琪院士與曾凡一教授，首次利用iPS細(xì)胞，通過四倍體囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，世界上首次證明了iPS細(xì)胞的全能性。

     下面對多能干細(xì)胞不同培養(yǎng)體系以及傳代方法進(jìn)行分析：

     多能干細(xì)胞最常見的培養(yǎng)體系有可以分為有血清培養(yǎng)系統(tǒng)跟無血清培養(yǎng)系統(tǒng)：

     有血清系統(tǒng)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配干細(xì)胞級血清，同時添加bFGF等生長因子，此方法對血清要求較高，在目前國內(nèi)血清比較亂的情況下，購買的合格的血清是制約細(xì)胞培養(yǎng)的主要因素，同時該體系還需要滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)方法較復(fù)雜。

     無血清干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)明大大簡化了干細(xì)胞培養(yǎng)流程，目前常用的為Gibco Essential8培養(yǎng)基與Stemcell Technologies 的mTesR系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)均為無血清，不需要額外添加生長因子，同時擺脫了滋養(yǎng)層細(xì)胞的限制，通過包被培養(yǎng)板就可以達(dá)到細(xì)胞貼壁的目的。但是，以上兩種培養(yǎng)基價格不菲，同時因為含有牛血清白蛋白（BSA）經(jīng)常會有進(jìn)口限制。以上產(chǎn)品也均有國內(nèi)替代，Applied Cell分別有人類多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（適用于Essential8 系統(tǒng)），以及Advance 人類多能干細(xì)胞培養(yǎng)基(適用于mTesR系統(tǒng))。

     培養(yǎng)皿包被：目前有兩種常見的包被方法，分別為Matrix基質(zhì)膠包被以及 Vitronectin包被，以上兩種膠對溫度非常敏感，操作要求較高，需要全程低溫操作，同時現(xiàn)配現(xiàn)用。針對以上問題現(xiàn)在多家公司均有有即用型基質(zhì)膠（Gibco,Stemcell Tech,Applied Cell）推出。

     傳代：干細(xì)胞傳代經(jīng)過多年發(fā)展也逐步簡化，最初通過膠原酶消化，挑克隆法傳代；后續(xù)發(fā)展出機械傳代發(fā)，多家公司也推出了細(xì)胞切割工具；至目前已經(jīng)可以做到使用消化液完成消化，消化液種類也多種多樣，分別有Accutase,Tryple以及無酶消化液，均可以達(dá)到很好的傳代效果。

以下另附多能干細(xì)胞培養(yǎng)操作手冊：

人類iPS/ES細(xì)胞復(fù)蘇操作：

      人類iPS/ES細(xì)胞的復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作包括實驗前準(zhǔn)備工作和實驗過程中的具體操作，下面即人類iPS/ES細(xì)胞的復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作：

1. 實驗前準(zhǔn)備工作：

1.1   基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，然后置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，在實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲存，并于1周內(nèi)使用。

注意：①干細(xì)胞復(fù)蘇過程中的基質(zhì)膠鋪板數(shù)由凍存細(xì)胞密度決定，一支凍存的干細(xì)胞的密度在1×106cells/mL左右，需要6孔板鋪1孔或12孔板鋪2孔基質(zhì)膠；②即用型基質(zhì)膠受熱易發(fā)生沉淀，即用即拿及時放回4℃冰箱保存且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2   實驗試劑平衡：人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）在實驗前置于室溫中避光平衡30min~1h。

1.3   超凈工作臺/生物安全柜照射紫外：在實驗前打開紫外燈照射30min進(jìn)行滅菌。

1.4   恒溫水浴鍋準(zhǔn)備：水浴鍋溫度設(shè)置在37℃用于hPSC細(xì)胞復(fù)蘇。

2. 實驗具體操作步驟：

2.1   提前加入人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）：復(fù)蘇前，先在15mL離心管中加入2~3mL的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基備用。

2.2   解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1~2min內(nèi)快速解凍；

注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

2.3   離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其吸出并緩慢逐滴滴入提前在15mL離心管中加入的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000rpm/min離心3min；

2.4   重懸：離心后棄上清加1mL人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000） 對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

2.5   接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細(xì)胞懸液，緩慢吹吸3~5次，待細(xì)胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補全每孔2 mL/1 mL的培養(yǎng)體系。

2.6   培養(yǎng)：接種后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈4個細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；

2.7   換液：從復(fù)蘇的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

       人類iPS/ES細(xì)胞擴增操作：

人類iPS/ES細(xì)胞的擴增標(biāo)準(zhǔn)操作包括實驗前準(zhǔn)備工作和實驗過程中的具體操作，下面即人類iPS/ES細(xì)胞的擴增標(biāo)準(zhǔn)操作：

1. 實驗前準(zhǔn)備工作：

1.1   基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，根據(jù)細(xì)胞密度決定傳代的孔數(shù)（細(xì)胞密度中等則可以按照1:2傳代，密度大則按照1:3或4傳代），并在每孔內(nèi)加入 1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，然后置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，在實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲存，并于1周內(nèi)使用。

注意：①通常早代次(<10代)的干細(xì)胞需要以較低的比例傳代，如1:2-1:3；成功建系的干細(xì)胞（10代以上）可以1:4-1:5的比例傳代，傳代的比例由細(xì)胞株的生長速率決定。比較理想的傳代時間間隔是3-5天一次，剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞第一次傳代時間一般是復(fù)蘇后第5天。②即用型基質(zhì)膠受熱易發(fā)生沉淀，即用即拿及時放回4℃冰箱保存且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2   實驗試劑平衡：人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）、人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008 ）以及PBS緩沖液在實驗前置于室溫中避光平衡30min~1h。

1.3   超凈工作臺/生物安全柜照射紫外：在實驗前打開紫外燈照射30min進(jìn)行滅菌。

2.   實驗具體操作步驟：

2.1   清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000），貼壁緩慢加入1 mL/0.5 mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；

2.2   消化：在6孔板/12孔板中加入1 mL/0.5 mL人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于CO2培養(yǎng)箱中2~5 min；

注意：消化時間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，如果密度中等且培養(yǎng)2~3天，消化時間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養(yǎng)4天以上消化時間可以控制在3 min~5min，消化時間快結(jié)束時可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。

2.3   吹打：吸掉人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的2mL/1mL干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000），用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，吹吸次數(shù)保持在3~5次，使皿底貼附的干細(xì)胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，制成干細(xì)胞懸液，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

2.4   接種：待皿底的細(xì)胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細(xì)胞懸液，緩慢吹吸1~2次，待細(xì)胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補全每孔2mL/1mL的培養(yǎng)體系。

2.5   培養(yǎng)：接種后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈4個細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；

2.6   換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

人類iPS/ES細(xì)胞凍存操作：

人類iPS/ES細(xì)胞的凍存標(biāo)準(zhǔn)操作包括實驗前準(zhǔn)備工作和實驗過程中的具體操作，下面即人類iPS/ES細(xì)胞的凍存標(biāo)準(zhǔn)操作：

1. 實驗前準(zhǔn)備工作：

1.1   實驗試劑平衡： 人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）、人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008）以及PBS緩沖液在實驗前置于室溫中避光平衡30min~1h。

1.2   超凈工作臺/生物安全柜照射紫外：在實驗前打開紫外燈照射30min進(jìn)行滅菌。

2. 實驗具體操作步驟：

2.1   清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000），貼壁緩慢加入2mL/1mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；

2.2   消化：在6孔板/12孔板中加入2mL/1mL人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于CO2培養(yǎng)箱中 2~5min；

注意：消化時間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，如果密度中等且培養(yǎng)2~3天，消化時間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養(yǎng)4天以上消化時間可以控制在3 min~5min ，消化時間快結(jié)束時可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。

2.3   吹打：吸掉人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的 1~2 mL人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000），用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，吹吸次數(shù)保持在3~5次，使皿底貼附的干細(xì)胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，制成干細(xì)胞懸液，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正常現(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

2.4   離心：待皿底的細(xì)胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000 rpm/min離心3 min；

2.5   重懸：離心后棄上清，加入1 mL Serum-Free干細(xì)胞高效凍存液（AC-1001011/AC- 1001012）對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次后，將其加入到1.8mL凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時放回4℃冰箱。通常生長狀態(tài)相同且同時消化的細(xì)胞統(tǒng)稱為一批細(xì)胞。

2.6   記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時間、操作者及細(xì)胞批次。

2.7   -80℃冰箱平衡：凍存管置于-80℃冰箱過夜。

注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

2.8   液氮凍存：凍存管置于 -80℃冰箱過夜后，第2天將其置于液氮中進(jìn)行長期保存。