如何利用光遺傳學(xué)技術(shù)研究下丘腦的神經(jīng)核團？

20 世紀(jì)末研究者們發(fā)現(xiàn)了食欲肽 (Orexin) 及 其受體在調(diào)節(jié)神經(jīng)活性和調(diào)節(jié)攝食行為方面的作用 。之后在動物在體實驗中又有研究發(fā)現(xiàn)這種神 經(jīng)元及受體還參與了睡眠與覺醒的轉(zhuǎn)換，并運用 基因敲除技術(shù)敲除 Orexin 基因研究其對睡眠狀態(tài) 的影響。在這些理論的基礎(chǔ)上，F(xiàn)errari 等將攜帶有編碼 VGAT 啟動子和 ChR2 的慢病毒注射 在轉(zhuǎn)基因小鼠的下丘腦外側(cè)區(qū)，采用光遺傳學(xué)技 術(shù)調(diào)控投射在該區(qū)域的 Orexin 能神經(jīng)元的 GABA 能神經(jīng)元軸突末梢，從而調(diào)控動物在睡眠到覺醒 狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。另有研究者采用小鼠動物模型利用 光遺傳學(xué)技術(shù)激活中縫背核 (dorsal raphe nucleus， DRN) 區(qū)五羥色胺能 (5-HT) 神經(jīng)元，記錄 Orexin 能 神經(jīng)元的突觸后反應(yīng)，結(jié)果顯示 5-HT 神經(jīng)元可能通過 5HT1A 受體直接抑制 Orexin 能神經(jīng)元，也可能通過調(diào)控 GABA 能神經(jīng)元間接抑制 Orexin 能神 經(jīng)元，進而調(diào)節(jié)動物的清醒狀態(tài)以及睡眠狀態(tài)。 此外也有在體研究用光遺傳刺激該核團，來研究 其與應(yīng)激焦慮相關(guān)的行為學(xué)表現(xiàn)，同時也引起了睡眠向覺醒的改變 。總之，Orexin 能神經(jīng)元因 其在腦內(nèi)投射廣泛，在未來的神經(jīng)環(huán)路研究中仍有著重要的意義。
 

 
下丘腦外側(cè)區(qū) MCH 神經(jīng)元與 Orexin 能神經(jīng)元 在腦內(nèi)投射區(qū)域基本相似，與 Orexin 能神經(jīng)元在 睡眠覺醒調(diào)節(jié)中有著互補的作用。在體動物實驗中 用光遺傳學(xué)方法刺激 MCH 神經(jīng)元可增加非快速動眼睡眠期 (non-rapid eye movement sleep，NREM) 及 快速動眼睡眠期 (rapid eye movement sleep，REM) 的睡眠時間。2016 年有研究結(jié)果顯示，在大鼠下丘腦注射攜帶 ChR2 的病毒，利用光遺傳學(xué)技術(shù) 分別采用 5 Hz、10 Hz 和 30 Hz 的藍光特異性激活 MCH 神經(jīng)元，可增加夜晚 REM 期及 NREM 期的 睡眠時間，白晝期間僅 REM 期睡眠增加。也有 在體研究指出在光刺激 MCH 后 NREM 期增加并且 腦電圖分析出現(xiàn)穩(wěn)定的慢波 Delta 波，以上兩種研 究的不同結(jié)果可能是與刺激的頻率方式以及刺激 部位不同導(dǎo)致的。MCH 神經(jīng)元既可促進 NREM 向 REM 期的轉(zhuǎn)換，同時也對 NREM 期睡眠的產(chǎn)生和 維持發(fā)揮作用。
 
MCH 神經(jīng)元被認(rèn)為是一種 GABA 能神經(jīng)元， 釋放GABA 抑制下游神經(jīng)元，最近有研究證實用 光遺傳學(xué)刺激中隔核外側(cè)區(qū) (lateral septal nucleus， LS) 的 MCH 神經(jīng)元軸突末端，通過電生理指標(biāo)發(fā) 現(xiàn) MCH 神經(jīng)元向 LS 區(qū)投射釋放谷氨酸使 LS 激活， 而谷氨酸同時激活了其他部位的 GABA 能神經(jīng)元， 這些 GABA 能神經(jīng)元也投射到 LS 區(qū)并形成了的前 饋抑制機制。之前研究發(fā)現(xiàn)只有在睡眠期才可以觀察到 MCH 神經(jīng)元的活動，最近有證據(jù)表明它 在覺醒期也有神經(jīng)活動 。上述發(fā)現(xiàn)證明 MCH 神經(jīng)元不只是一種 GABA 能神經(jīng)元而且還釋放谷氨 酸影響下游神經(jīng)元，可能參與覺醒期的調(diào)節(jié)，未來也可以研究 MCH 神經(jīng)元與 Orexin 之間是否存在 協(xié)同作用，并尋找在覺醒期調(diào)節(jié)方面的相關(guān)環(huán)路。
 
結(jié)節(jié)乳頭核是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中組胺的唯一來源，雖然已經(jīng)知道腹外側(cè)視交叉前區(qū)是主要的睡 眠激活中心，也知道組胺能神經(jīng)元在覺醒中的 作用，但仍然不知道哪些神經(jīng)環(huán)路參與其中。 Williams 等將光遺傳學(xué)技術(shù)與電生理技術(shù)結(jié)合 來探究 TMN 區(qū)組胺能神經(jīng)元與 VLPO 區(qū) GABA 能神經(jīng)元在促進覺醒功能中的神經(jīng)環(huán)路，用組氨酸 脫羧酶 -Cre 小鼠結(jié)合 ChR2-mCherry 表達在結(jié)節(jié) 乳頭核腹外側(cè)區(qū) (vlTMN) 的組胺能神經(jīng)元，在光 刺激相應(yīng)區(qū)域后可以用電生理技術(shù)記錄 vlTMN 神 經(jīng)元和 VLPO 神經(jīng)元中的自發(fā)抑制性突觸后電流 (sIPSC)，發(fā)現(xiàn)從 TMN 區(qū)釋放的組胺通過 H3 受體 可以減少 GABA 能神經(jīng)元向 vlTMN 神經(jīng)元的傳 入從而對自身進行去抑制，并且組胺能神經(jīng)元可 以通過 H1 受體激活 GABA 中間神經(jīng)元從而抑制 VLPO 區(qū) GABA 能神經(jīng)元對 vlTMN 區(qū)的抑制，以 激活 TMN 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞。VLPO 區(qū)神經(jīng)元和 TMN 區(qū) 神經(jīng)元彼此相互抑制，激活一個相應(yīng)的會抑制另 外一個的表達。這一結(jié)果驗證了之前研究中睡眠 與覺醒調(diào)節(jié)的“觸發(fā)開關(guān)”假說，使睡眠或覺醒 狀態(tài)轉(zhuǎn)換迅速。Neuron 的一篇小鼠在體光遺傳學(xué) 研究顯示，組胺能神經(jīng)元以旁分泌形式釋放 GABA 來參與睡眠調(diào)節(jié)，敲除轉(zhuǎn)基因小鼠組胺能神經(jīng)元中的 VGAT 基因 ( 編碼 GABA 轉(zhuǎn)運體 ) 可導(dǎo)致覺 醒期額外增加。這樣的自身調(diào)節(jié)機制可能是為 了使睡眠覺醒趨于一個穩(wěn)定的狀態(tài)，防止組胺能 神經(jīng)過度激活，導(dǎo)致睡眠覺醒調(diào)節(jié)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)紊亂。 也許其他神經(jīng)元中也有類似的機制，使大腦中神經(jīng)環(huán)路調(diào)節(jié)穩(wěn)定。

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康森特生物科技（長沙）有限公司代理的 inper光遺傳系統(tǒng)把光學(xué)和遺傳學(xué)手段結(jié)合起來，通過基因操控技術(shù)將感光基因轉(zhuǎn)入到神經(jīng)系統(tǒng)特定類型的神經(jīng)元，然后通過相應(yīng)波長的光激活該蛋白從而實現(xiàn)精確操控神經(jīng)元。根據(jù)實驗需求精確控制特定神經(jīng)元的興奮與抑制，從而為揭示大腦中的神經(jīng)環(huán)路所介導(dǎo)的功能提供便捷有效的方法。