葉綠素知識與葉綠素熒光測定的原理（上）

1983年，WALZ公司首席科學家，德國烏茲堡大學教授Ulrich Schreiber博士利用調(diào)制技術和飽和脈沖技術，設計制造了全世界第一臺脈沖振幅(Pulse-Amplitude-Modulation，PAM)熒光儀——PAM-101/102/103。

所謂調(diào)制技術，就是說用于激發(fā)熒光的測量光具有一定的調(diào)制(開/關)頻率，檢測器只記錄與測量光同頻的熒光，因此調(diào)制熒光儀允許測量所有生理狀態(tài)下的熒光，包括背景光很強時。正是由于調(diào)制技術的出現(xiàn)，才使得葉綠素熒光由傳統(tǒng)的“黑匣子”(避免環(huán)境光)測量走向了野外環(huán)境光下測量，由生理學走向了生態(tài)學。

經(jīng)過充分暗適應后，所有電子門均處于開放態(tài)，打開測量光得到Fo，此時給出一個飽和脈沖，所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm。根據(jù)Fm和Fo可以計算出PS II的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潛在最大光合能力。

所謂飽和脈沖技術，就是打開一個持續(xù)時間很短(一般小于1 s)的強光關閉所有的電子門(光合作用被暫時抑制)，從而使葉綠素熒光達到最大。飽和脈沖(Saturation Pulse, SP)可被看作是光化光的一個特例。光化光越強，PS II釋放的電子越多，PQ處累積的電子越多，也就是說關閉態(tài)的電子門越多，F越高。當光化光達到使所有的電子門都關閉(不能進行光合作用)的強度時，就稱之為飽和脈沖。

打開飽和脈沖時，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素熒光和熱，F達到最大值。

在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于開放態(tài)。如果給出一個飽和脈沖，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm’。根據(jù)Fm’和F可以求出在當前的光照狀態(tài)下PS II的實際量子產(chǎn)量Yield=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物目前的實際光合效率。

光照狀態(tài)下打開飽和脈沖時，電子門被完全關閉，光合作用被暫時抑制，也就是說光化學淬滅被全部抑制，但此時熒光值還是比Fm低，也就是說還存在熒光淬滅，這些剩余的熒光淬滅即為非光化學淬滅。淬滅系數(shù)的計算公式為：qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’);qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo);NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。

在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于關閉態(tài)，實時熒光F比Fm要低，也就是說發(fā)生了熒光淬滅(quenching)。植物吸收的光能只有3條去路：光合作用、葉綠素熒光和熱。根據(jù)能量守恒：1=光合作用+葉綠素熒光+熱?？梢缘贸觯喝~綠素熒光=1-光合作用-熱。也就是說，葉綠素熒光(葉綠素熒光測定儀)產(chǎn)量的下降(淬滅)有可能是由光合作用的增加或熱耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學淬滅(photochemical quenching, qP);由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學淬滅(non-photochemical quenching, qN或NPQ)。光化學淬滅反映了植物光合活性的高低;非光化學淬滅反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，也就是光保護能力。

根據(jù)PS II的實際量子產(chǎn)量ΔF/Fm’和光合有效輻射(Photosynthetically Active Radiation, PAR)還可計算出光合電子傳遞的相對速率rETR=ΔF/Fm’·PAR·0.84·0.5。其中0.84是植物的經(jīng)驗性吸光系數(shù)，0.5是假設植物吸收的光能被兩個光系統(tǒng)均分。

當F達到穩(wěn)態(tài)后關閉光化光，同時打開遠紅光(Far-red Light, FL)(約持續(xù)3-5 s)，促進PS I迅速吸收累積在電子門處的電子，使電子門在很短的時間內(nèi)回到開放態(tài)，F回到最小熒光Fo附近，此時得到的熒光為Fo’。由于在野外測量Fo’不方便，因此野外版的調(diào)制熒光儀(除PAM-2100和WATER-PAM)外，多數(shù)不配置遠紅光。此時可以直接利用Fo代替Fo’來計算qP和qN，盡管得到的參數(shù)值有輕微差異，但qP和qN的變化趨勢與利用Fo’計算時是一致的。由于NPQ的計算不需Fo’，近10幾年來得到了越來越廣泛的應用。

2常用型號

葉綠素- 分類

葉綠素分為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c、葉綠素d、原葉綠素和細菌葉綠素等。

葉綠素名稱存在場所最大吸收光帶

葉綠素a所有綠色植物中紅光和藍紫光

葉綠素b高等植物、綠藻、眼蟲藻、管藻紅光和藍紫光

葉綠素c硅藻、甲藻、褐藻紅光和藍紫光

葉綠素d紅藻紅光和藍紫光

原葉綠素黃化植物(幼苗期)近于紅光和藍紫光

細菌葉綠素紫色細菌紅光和藍紫光

19世紀初，俄國化學家、色層分析法創(chuàng)始人M.C.茨韋特用吸附色層分析法證明高等植物葉子中的葉綠素有兩種成分。德國H.菲舍爾等經(jīng)過多年的努力，弄清了葉綠素的復雜的化學結(jié)構。1960年美國R.B.伍德沃德領導的實驗室合成了葉綠素a。至此,葉綠素的分子結(jié)構得到定論。(手持式葉綠素測定儀)

葉綠素分子是由兩部分組成的：核心部分是一個卟啉環(huán)(porphyrin ring)，其功能是光吸收;另一部分是一個很長的脂肪烴側(cè)鏈，稱為葉綠醇(phytol)，葉綠素用這種側(cè)鏈插入到類囊體膜。與含鐵的血紅素基團不同的是，葉綠素卟啉環(huán)中含有一個鎂原子。葉綠素分子通過卟啉環(huán)中單鍵和雙鍵的改變來吸收可見光。各種葉綠素之間的結(jié)構差別很小。如葉綠素a和b僅在吡咯環(huán)Ⅱ上的附加基團上有差異：前者是甲基，后者是甲醛基。細菌葉綠素和葉綠素a不同處也只在于卟啉環(huán)Ⅰ上的乙烯基換成酮基和環(huán)Ⅱ上的一對雙鍵被氫化。

葉綠素 - 化學性質(zhì)

高等植物葉綠體中的葉綠素主要有葉綠素a 和葉綠素b 兩種。它們不溶于水，而溶于有機溶劑，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。葉綠素a分子式：C55H72O5N4Mg;葉綠素b分子式：C55H70O6N4Mg。在顏色上，葉綠素a 呈藍綠色，而葉綠素b 呈黃綠色。按化學性質(zhì)來說，葉綠素是葉綠酸的酯，能發(fā)生皂化反應。葉綠酸是雙羧酸，其中一個羧基被甲醇所酯化，另一個被葉醇所酯化。

葉綠素分子含有一個卟啉環(huán)的“頭部”和一個葉綠醇的“尾巴”。鎂原子居于卟啉環(huán)的中央，偏向于帶正電荷，與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負電荷，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合。葉醇是由四個異戊二烯單位組成的雙萜，是一個親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性。葉綠素不參與氫的傳遞或氫的氧化還原，而僅以電子傳遞(即電子得失引起的氧化還原)及共軛傳遞(直接能量傳遞)的方式參與能量的傳遞。

卟啉環(huán)中的鎂原子可被氫離子、銅離子、鋅離子所置換。用酸處理葉片，氫離子易進入葉綠體，置換鎂原子形成去鎂葉綠素，使葉片呈褐色。去鎂葉綠素易再與銅離子結(jié)合，形成銅代葉綠素，顏色比原來更穩(wěn)定。人們常根據(jù)這一原理用醋酸銅處理來保存綠色植物標本。 葉綠醇是親脂的脂肪族鏈，由于它的存在而決定了葉綠素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有機溶劑中。由于在結(jié)構上的差別，葉綠素a呈藍綠色，b呈黃綠色。在光下易被氧化而退色。葉綠素是雙羧酸的酯，與堿發(fā)生皂化反應。

葉綠素不很穩(wěn)定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解。酸性條件下，葉綠素分子很容易失去卟啉環(huán)中的鎂成為去鎂葉綠素。葉綠素溶液能進行部分類似光合作用的反應，在光下使某些化合物氧化或還原。人工制備的葉綠素膜在光下能產(chǎn)生光電位和光電流，也能催化某些氧化還原反應。

葉綠素 - 光和作用

光合作用是指綠色植物通過葉綠體，利用光能，把二氧化碳和水轉(zhuǎn)化成儲存著能量的有機物，并且釋放出氧的過程。光合作用的第一步是光能被葉綠素吸收并將葉綠素離子化。產(chǎn)生的化學能被暫時儲存在三磷酸腺苷(ATP)中，并最終將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為碳水化合物和氧氣。