在液相色譜儀檢測(cè)分析過程中，硅膠色譜柱上被吸附的樣品成分累積到一定程度時(shí)，就開始形成新的固定相。新的檢測(cè)物質(zhì)能與殘留雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理，從而導(dǎo)致保留時(shí)間波動(dòng)，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。隨著時(shí)間的積累，色譜柱的反壓就會(huì)超過泵所能承受的最大壓力，使色譜柱無(wú)法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。
    再生被污染的液相色譜柱的關(guān)鍵是了解污染物的性質(zhì)并且找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬宄?。如果污染是因?yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時(shí)強(qiáng)保留物質(zhì)的累積引起的，可用90～100%較強(qiáng)的溶劑沖洗20個(gè)體積可以清除污染物。例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會(huì)使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，這樣會(huì)導(dǎo)致更大的問題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無(wú)緩沖流動(dòng)相（即把緩沖液換成水）沖洗5～10個(gè)體積以后才更換強(qiáng)溶劑。
    有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要使用更強(qiáng)的溶劑或者多重溶劑來清洗柱子。一般來說，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強(qiáng)度增加，經(jīng)常最后一個(gè)溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯），可以用來溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。在使用多重溶劑時(shí)，須保證每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑互混。清洗過程要結(jié)束時(shí)，必須借助一個(gè)中等強(qiáng)度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個(gè)非常好的作為中間步驟的溶劑，因?yàn)樗芘c正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。當(dāng)然，如果使用紫外檢測(cè)器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。
硅膠鍵合柱常用的緩沖溶液可使用以下溶劑：100%甲醇、100%乙腈、75%乙腈－25%異丙醇、100%異丙醇、100%二氯甲烷、100%正己烷。用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來的水相溶劑，每種溶劑至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，可以用1～2ml/min的流速來沖洗，要回復(fù)原來的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。中間步驟可使用異丙醇，然后用沒有緩沖的流動(dòng)相，最后回復(fù)起始流動(dòng)相配置。四氫呋喃是另外一種教常用的去除污染的溶劑。如果色譜柱被嚴(yán)重污染，可以二甲基亞砜或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過色譜柱。成功再生反相柱子是一個(gè)非常耗時(shí)間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度洗脫系統(tǒng)操作；還有一個(gè)問題是清洗過程中是否可以反沖HPLC色譜柱，因?yàn)榇蠖鄶?shù)強(qiáng)保留的污染物都會(huì)累積在柱頭，把柱子反過來可以縮短污染物被沖出柱子的移動(dòng)距離?？紤]到裝填柱子的穩(wěn)定性，現(xiàn)在大多數(shù)HPLC柱子都是比普通操作壓力大很多的高壓裝填的，因此他們的柱床應(yīng)該不會(huì)受到反方向流速的影響。但是，如果頭上的燒結(jié)比尾部的燒結(jié)孔徑大的話。例如尾部燒結(jié)的孔徑是2μm，通常能夠留住平均5μm孔徑里的填料。如果這種孔徑大于裝填顆粒尺寸分布曲線的最小粒徑時(shí)，有些填料能穿過這些縫隙而流出色譜柱，這樣會(huì)導(dǎo)致空白出現(xiàn)。
清洗色譜柱的頻率主要看有多少?gòu)?qiáng)保留物質(zhì)流經(jīng)色譜柱，因?yàn)榉聪嘀袝r(shí)候在分辨率消失或者鬼峰出現(xiàn)前能承受很大的污染，使用者經(jīng)常會(huì)等到出現(xiàn)了異常情況才開始注意。然而，污染物過多的累積會(huì)導(dǎo)致清洗柱子的難度加大。所以，經(jīng)常用雜質(zhì)較多的樣品上樣時(shí)，應(yīng)當(dāng)有規(guī)律地清洗柱子。


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