概述

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是由鐮孢菌(霉)屬產(chǎn)生的一種低分子量的單端孢霉烯族真菌毒素。這些真菌廣泛存在，可以感染大麥，谷物、小麥和玉米。這種毒素是劇毒可以造成免疫功能紊亂，因此避免豬食入。又稱為嘔吐毒素。

適用

這個REAGEN嘔吐毒素檢測試劑盒的原理是競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)，用于定量檢測谷物、小麥和玉米和動物飼料中的嘔吐毒素。

原理

這個REAGEN嘔吐毒素檢測試劑盒的原理是固相直接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)。聚苯乙烯微孔板中包被抗嘔吐毒素的特異性抗體。利用蒸餾水或無離子水提取樣品中的嘔吐毒素，把提取的樣品和HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的嘔吐毒素混勻并加入對應(yīng)的孔檢測。酶標(biāo)記毒素與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的嘔吐霉毒素競爭與包被在微孔底部的抗體結(jié)合。孵育一段時間后，倒出孔里的液體，清洗除去沒有反應(yīng)的物質(zhì)后加入顯色底物（TMB），在酶的作用下孔里將會出現(xiàn)藍色。顯色顏色的深淺與結(jié)合物的量成正比例的關(guān)系，與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中DON的量成反比例關(guān)系。所以，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的DON濃度越高，顯色的藍色將會越淺。加入酸，終止反應(yīng)，底物顏色由藍色變?yōu)樽攸S色。微孔板放進酶標(biāo)儀里，在OD450nm讀取吸光度值。樣品的吸光度值與試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)OD值相比較，相對應(yīng)得出結(jié)果。

試劑盒組成
1×小袋
抗體包被的微孔板
96孔板（12×8微孔板、包被用鼠源嘔吐毒素抗體）

1×
預(yù)混板（綠色）
96孔板（12×8）沒有包被抗體

6×小瓶
DON標(biāo)準(zhǔn)品
1.5mL/瓶，DON的濃度分別為0, 10, 20, 50, 100, and 200 ng/mL

2×小瓶
HRP-DON偶聯(lián)物
2 x 12mL HRP-DON添加防腐劑的緩沖溶液

1×小瓶
底物試劑
15mL TMB，

1×小瓶
終止液
15mL酸性液體


樣品提取步驟

注意：樣品必須按照有關(guān)規(guī)定收集

1、研磨樣品（使50%的樣品可以通過一個20目的濾網(wǎng)）。

2、稱量20g研磨過濾后的樣品加入100ml蒸餾水或無離子水，樣品稀釋比為1:5(w/v)。

3、在密封的容器里混合上至少震蕩3分鐘。

4、靜置、用濾紙過濾5-10ml以上處理的液體，收集濾液。

5、以1：10的比例稀釋濾液（取1ml樣品提取液然后加入9ml的蒸餾水或無離子水）。

6、樣品最終稀釋倍數(shù)為1：50，待測。

樣品測定步驟

注意：在操作時推薦使用排槍，同時每個樣品都做2個平行。

1、使用前將試劑拿到室溫。

2、取出混合板放于微孔支架上用于標(biāo)準(zhǔn)和樣品的測試，取相同數(shù)量的微孔（包被有抗體）置于另一個微孔支架上。

3、在每個混合板微孔中加入200μl酶標(biāo)結(jié)合物。

4、在對應(yīng)的孔中加入100μl標(biāo)準(zhǔn)或樣品，用槍頭混合3次，

注意：操作者要把每個孔標(biāo)記清楚

5、轉(zhuǎn)移100ul預(yù)混板微孔中的液體到對應(yīng)的包被有抗體的微孔中，室溫孵育15分，最好使用多道移液器。

6、將孔里的液體倒入合適的容器中，用蒸餾水或無離子水洗板，然后迅速棄掉洗液到合適的容器中，重復(fù)洗5次。在一層厚的吸水紙上拍板，去掉殘留的洗液。

7、在吸水紙上拍打，盡可能地將水拍干。

8、每孔加入100μl底物溶劑，室溫孵育5min。

9、每孔加入100μl終止液。

10、對比標(biāo)準(zhǔn)和樣品的顏色，或在OD450 nm讀數(shù)。

結(jié)果分析

使用實驗獲得的OD值與嘔吐毒素0標(biāo)準(zhǔn)的OD值的百分比值與標(biāo)準(zhǔn)中嘔吐毒素含量建立劑量效應(yīng)曲線（或直接用OD值與標(biāo)準(zhǔn)的濃度構(gòu)建劑量效應(yīng)曲線）。通過在標(biāo)準(zhǔn)品曲線中添加新數(shù)值計算被測物質(zhì)中嘔吐毒素的濃度。因為樣品在處理的過程中稀釋了50倍，所以在計算結(jié)果時要乘以稀釋倍數(shù)50。