上海卓康以質(zhì)量為本，樹立“卓康質(zhì)量”是公司的發(fā)展目標(biāo)。我們一直加倍努力，竭盡全力做到不辜負(fù)您的支持與信賴。同時公司也離不開廣大客戶的幫助支持，真誠邀請國內(nèi)外有實力的實驗室、生物技術(shù)公司合作，共同發(fā)展。 目前卓康提供的服務(wù)范圍包括：生物合成siRNA、shRNA的制備；轉(zhuǎn)錄編碼shRNA的DNAs、轉(zhuǎn)錄編碼shRNA的質(zhì)粒載體訂購；siRNA靶位的設(shè)計和實驗選擇分析；siRNA相關(guān)試劑和RNA技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品的代理銷售；重組病毒構(gòu)建包裝；基因蛋白表達(dá)、載體構(gòu)建、多克隆抗體和單克隆抗體制備；多種細(xì)胞學(xué)服務(wù)；常用的分子生物學(xué)試劑、實驗儀器、實驗耗材銷售等。 卓康在分子生物學(xué)和免疫學(xué)實驗技術(shù)，特別抗體制備技術(shù)方面同樣具有豐富經(jīng)驗，提供快速、優(yōu)質(zhì)、性價比高的實驗服務(wù)。 十、代做實驗實時熒光定量PCR(RealTime PCR)技術(shù)服務(wù)（代做RT-PCR實驗） ●熒光定量PCR概述 　　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個能對核酸分子進(jìn)行精確定量的有力工具。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)展，定量PCR技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，實時定量PCR (real-time quantitative PCR)技術(shù)便是一種具有革命性意義的定量PCR技術(shù)。所謂實時定量PCR是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。 　　目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，僅2000-2001年，收錄在Medline上的以real-time PCR為關(guān)鍵詞的文章就達(dá)1000多篇。實時PCR技術(shù)較之以前的以終點法進(jìn)行定量的PCR技術(shù)具有無與倫比的優(yōu)勢。首先，它不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴增并進(jìn)行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進(jìn)行操作。 　　實時熒光定量PCR技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測定量產(chǎn)生的偏差，提高實驗的重復(fù)性。該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果。 Sunbio為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進(jìn)口試劑完成，定量PCR儀器為Corbett Research 公司生產(chǎn)的離心式實時定量PCR儀Rotor-Gene 3000。 ●熒光定量化學(xué)原理介紹 ☆TaqMan熒光探針 PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如圖所示。 ☆SYBR Green熒光染料 SYBR Green是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。它的最大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應(yīng)體系中。從經(jīng)濟角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴增，那它就會影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響。 ●熒光定量PCR中的一些術(shù)語 1. CT值：熒光信號有統(tǒng)計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環(huán)次數(shù)，或者說是從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。 2. 閾值：閾值的默認(rèn)設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。 3.CT值與起始模板的量成線性關(guān)系，數(shù)學(xué)原理如圖所示： ●主要實驗步驟如下： 1. 設(shè)計并合成Realtime PCR引物。 2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR® Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。 3. 客戶樣品RNA抽提 實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。 實驗對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA 4. RNA質(zhì)量檢測 a. 紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度 b. 使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。 5. 使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 6. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品： 進(jìn)行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 7. 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中（其中TaqBeadTM熱啟動聚合酶來自Promega公司），進(jìn)行RealTime PCR擴增和檢測。 8. 檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：以對待測樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對定量實驗需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對含量。 9. 提供實驗報告：包括詳細(xì)的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果的相關(guān)圖表 ●實時定量PCR全套技術(shù)服務(wù)收費標(biāo)準(zhǔn) ☆實驗步驟 1至9個標(biāo)本10個標(biāo)本以上 組織或細(xì)胞RNA抽提 RNA質(zhì)量檢測 cDNA制備 300元(一個組織或細(xì)胞標(biāo)本) 270元(一個組織或細(xì)胞標(biāo)本) 目的基因?qū)崟r定量PCR 看家基因?qū)崟r定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 數(shù)據(jù)分析 200元(一個標(biāo)本一個指標(biāo)) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及看家基因內(nèi)參免費 180元(一個標(biāo)本一個指標(biāo)) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及看家基因內(nèi)參免費 ☆全套技術(shù)服務(wù) 您只需提供組織或細(xì)胞標(biāo)本，我們?yōu)槟瓿蒖NA抽提，cDNA制備，實時定量PCR，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及數(shù)據(jù)分析的所有步驟。 標(biāo)本的運輸費用及引物合成費用客戶自理 如需制作PCR電泳效果圖，每張(1至9個標(biāo)本一張)收取100元 上海卓康生物科技有限公司 聯(lián)系電話：021－55660344，021－55063976 傳真：021－55660344 網(wǎng)址：www.elisabio.com 網(wǎng)址：www.antibodybio.com 聯(lián)系人：黃力，業(yè)務(wù)qq: 909447355 公司對外郵箱：sales@elisabio.com，hyperheal@gmail.com