上海卓康以質(zhì)量為本，樹立“卓康質(zhì)量”是公司的發(fā)展目標(biāo)。我們一直加倍努力，竭盡全力做到不辜負(fù)您的支持與信賴。同時公司也離不開廣大客戶的幫助支持，真誠邀請國內(nèi)外有實力的實驗室、生物技術(shù)公司合作，共同發(fā)展。 目前卓康提供的服務(wù)范圍包括：生物合成siRNA、shRNA的制備；轉(zhuǎn)錄編碼shRNA的DNAs、轉(zhuǎn)錄編碼shRNA的質(zhì)粒載體訂購；siRNA靶位的設(shè)計和實驗選擇分析；siRNA相關(guān)試劑和RNA技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品的代理銷售；重組病毒構(gòu)建包裝；基因蛋白表達(dá)、載體構(gòu)建、多克隆抗體和單克隆抗體制備；多種細(xì)胞學(xué)服務(wù)；常用的分子生物學(xué)試劑、實驗儀器、實驗耗材銷售等。 卓康在分子生物學(xué)和免疫學(xué)實驗技術(shù)，特別抗體制備技術(shù)方面同樣具有豐富經(jīng)驗，提供快速、優(yōu)質(zhì)、性價比高的實驗服務(wù)。 九、Western Blotting免疫蛋白印跡技術(shù)服務(wù)（代做wb實驗） WESTERN BLOT是以電泳分離組分，將其從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，繼之以針對特定氨基酸序列的特異性抗體作為探針檢測目的蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。 免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。 上海卓康生物科技有限公司為您提供全套免疫印跡(Western blotting)技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用高質(zhì)量試劑完成 ●主要實驗步驟如下： 1. 蛋白質(zhì)抽提 a.實驗對象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。 b.實驗對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。 2. 蛋白質(zhì)定量 按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。 3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE) 將準(zhǔn)備好的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)第一個孔中，電泳分離蛋白。 4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜 按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜。 5. 膜的封閉和抗體孵育 a．膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結(jié)合。 b.封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育1.5小時，抗原抗體結(jié)合。 c.加入HRP標(biāo)記的二級抗體以結(jié)合一級抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。。 6. 結(jié)果檢測 化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。 7. 數(shù)據(jù)分析 目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。 8. 提供實驗報告 包括詳細(xì)的實驗方法及免疫印跡實驗結(jié)果的相關(guān)圖表。。 試劑耗材： SDS、甘油、Tris、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED，APS、甘氨酸、甲醇、PVDF膜、Brandford蛋白定量試劑盒、BSA、脫脂奶粉、考麻斯亮藍(lán)、麗春紅、氯化鈉、氯化鉀、DTT、ECL、顯影液、定影液等、顯影膠片。 儀器設(shè)備： 超聲儀、核酸蛋白定量儀、Western-blot電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、搖床、曝光合、紅燈等。 樣本準(zhǔn)備：收集106細(xì)胞，加入150μl，冰上超聲5次，定量。 SDS-PAGE 電泳： 1.準(zhǔn)備各溶液。 小燒杯兩個，5ml槍頭6個，吸水紙，罐膠電泳設(shè)備。 2.準(zhǔn)備罐膠槽。 將玻璃板擦干凈，放入短架子內(nèi)，薄板靠門，兩玻璃板及架子的底緣須在同一平面（否則漏膠）；將濕潤的墊片墊于長架子上并鋪上密封膜；將短架子裝在長架子上（短架子底緣須與墊片緊密接觸，否則漏膠）。 3.準(zhǔn)備配膠。 將各溶液（ddH2O，單體，Tris-HCl，SDS，TEMED，APS）依次擺好，5ml槍頭插于長罐膠槽，調(diào)好取TEMED、APS的槍。 4.配分離膠。 在一小燒杯上裝半杯ddH2O；另一小燒杯依次加上述各液（加TEMED、APS時要迅速），快速搖勻。 注：膠濃度由需要檢測的蛋白大小決定。 5.罐膠。 從玻璃板中間注入膠液，注膠速度均勻，不要產(chǎn)生氣泡。罐膠后用ddH2O壓膠。 6.等待時： 將Tris-HCl換成pH6.8。換取Tris-HCl及罐膠用的槍頭。調(diào)好各移液器。 7.30分鐘后。 倒掉壓膠水，用濾紙吸干殘留水，注意不要觸及膠面。 8.配集成膠。 參見步驟4。 9.罐膠。 參見步驟5，灌滿為止，不要有氣泡。 10.插梳。 梳柱下面不要有氣泡。 11.等待時。 A：配電泳緩沖液。B：將樣本煮沸5分鐘。C：水中冷卻，短暫離心后依加樣序排放好。D：等膠近凝時，將玻璃板裝在電泳架子上，罐內(nèi)槽液于槽中，檢查是否密封。E：將上槽架子按于槽中。 12.30分鐘后。 罐上槽液超過短玻璃板，拔梳（注意力道適中，不能太快）。放置上樣架子。 13.上樣30μl。 槍頭先伸入至快接近膠面時開始降將上樣液緩緩打出，使樣品液從膠面往上漲，槍頭隨液面上漲而上提。可以不把最后一滴樣品打出，但是每個樣品都須同樣處理。 14.加外槽液。 15.電泳。 轉(zhuǎn)膜： 1.準(zhǔn)備。 分別準(zhǔn)備泡膜和轉(zhuǎn)膜用的試劑和用具，在電泳槽中倒好轉(zhuǎn)膜液 2.揭膠。 電泳結(jié)束后，將電泳槽移至水池中，倒掉電泳液，將內(nèi)槽提起放在水池邊，取出兩邊玻璃板。用純水沖干凈玻璃板，小心揭開短板，去掉集成膠，小心將膠轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)膜液在中。 3.轉(zhuǎn)膜。 將夾子打開，黑色在底，依次放置海綿、濾紙、膠、膜、濾紙、海綿，關(guān)好夾子（均在液面下進(jìn)行，注意氣泡）快速放入架子中。在電泳槽中放冰袋。 4.電泳。 封閉及孵抗體： 1.轉(zhuǎn)膜等待時 準(zhǔn)備封閉液（即Non-fat milk 5% in TBST）。 2.轉(zhuǎn)膜完畢后， 將膜放入封閉液中，輕搖孵育1小時。 3.孵一抗。 將封閉好的膜在轉(zhuǎn)移到一抗盒子中，室溫孵育兩小時或4℃過夜， 4.洗滌 將孵育好一抗的膜在TBST洗滌3次，每次5分鐘。 5.孵二抗。 將洗好的膜放在二抗中室溫孵育兩小時。 6.洗滌。 將孵育好二抗的膜在TBST洗滌3次，每次5分鐘。 7.ECL化學(xué)發(fā)光和曝光顯影。 客戶方需提供： 1、 第一抗體( 如Cell signaling technology, Cayman Chemical, Santan Cruz, Zymed等著名抗體公司。) 2、 預(yù)實驗樣本 3、 正式實驗樣本 ★ 公司方提供： 1、 預(yù)實驗結(jié)果 2、 正式實驗結(jié)果 如客戶只需要進(jìn)行預(yù)實驗研究，我方可只代理預(yù)實驗業(yè)務(wù)并提供結(jié)果。 ★ 實驗周期與費(fèi)用： 預(yù)實驗的費(fèi)用以欲檢測目的蛋白的種類數(shù)目（或第一抗體種類數(shù)目）計算，公司將在材料和實驗經(jīng)費(fèi)全部到位的工作日后20個工作日之內(nèi)提交實驗結(jié)果。正式實驗費(fèi)用欲檢測目的蛋白的種類數(shù)目（或第一抗體種類數(shù)目）和樣本數(shù)為單位計算，實驗周期為20個工作日，公司將在材料和預(yù)付的實驗經(jīng)費(fèi)全部到位的工作日后20個工作日之內(nèi)提交實驗結(jié)果。如客戶要求在10個工作日之內(nèi)完成，每單位樣品費(fèi)用為常規(guī)周期的兩倍。實驗結(jié)果以膠片的形式提交給客戶 。 收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn) 項目 價格 總蛋白質(zhì)提取 50 元每個樣品 WB 實驗費(fèi) 每張膜可做1-8個樣品 1400元/膜 WB 預(yù)實驗費(fèi) 600元每個指標(biāo) 上海卓康生物科技有限公司 聯(lián)系電話：021－55660344，021－55063976 傳真：021－55660344 網(wǎng)址：www.elisabio.com 網(wǎng)址：www.antibodybio.com 聯(lián)系人：黃力，業(yè)務(wù)qq: 909447355 公司對外郵箱：sales@elisabio.com，hyperheal@gmail.com