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黃曲霉毒素M1 ELISA檢測試劑盒
961AFLM01M
概況
黃曲霉毒素(Aflatoxin, AF）是由多種霉菌代謝的毒性產(chǎn)物，例如Asperillus flavus 和Asperillus parasiticus霉菌。他們具有致癌性，存在與谷物、堅果、棉籽和其他人類商品食物中或動物飼料中。谷物可能被黃曲霉毒素的衍生物：B1、B2、G1和G2其中一種污染或者被多種毒素污染。AFB1是目前檢測到的最毒的毒素。其他類型毒素如果污染的濃度很高也存在很大的危險。黃曲霉毒素能夠引發(fā)人類很多病癥包括肝癌、黃曲霉中毒、萊耶綜合癥和慢性肝炎。動物容易攝取到黃曲霉毒素，原因是動物吃的飼料在生長、收割和貯存過程中能被黃曲霉毒素產(chǎn)生的真菌毒素污染。當(dāng)奶牛吃了被污染的飼料，AFB1在體內(nèi)羥基化轉(zhuǎn)化成AFM1，AFM1常在牛乳中被檢測到。如果牛初乳中存在AFM1，針對一般的牛奶處理方法例如巴氏殺菌，但AFM1是非常穩(wěn)定的，它可能一直留存到人類最終消費產(chǎn)品中。世界上大多數(shù)國家的政府已經(jīng)對人類和動物性食品中制定了嚴(yán)格的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。很多國家已經(jīng)聲明降低牛奶和奶制品中的AFM1限量標(biāo)準(zhǔn)。歐盟已經(jīng)將牛奶和奶制品中AFM1的限量定為0.05ug/L或者50ppt。
使用目的
HELICA AFM1 分析測定試劑盒目的是用來定量檢測牛奶、奶粉和乳酪中的AFM1。
分析原理
HELICA AFM1 分析測定是一種固相競爭酶聯(lián)免疫分析測定方法。聚苯乙烯微孔板中包被抗AFM1的高親和力抗體。將標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品加入合適的微孔中，如果存在AFM1，它將和包被的抗體結(jié)合。接下來，加入HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的毒素，標(biāo)記毒素與標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品與抗體沒有結(jié)合的部位相結(jié)合。孵育一段時間后，倒出孔里的液體，清洗后加入顯色底物，在酶的作用下孔里將會出現(xiàn)藍色。顯色顏色的深淺與結(jié)合物的量成正比例的關(guān)系，與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中AFM1的量成反比例關(guān)系。所以，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的AFM1濃度越高，顯色的藍色將會越淺。加入酸，終止反應(yīng)，底物顏色由藍色變?yōu)樽攸S色。微孔板放進酶標(biāo)儀里，在OD450nm 讀取吸光度值。樣品的吸光度值與試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)OD值相比較，相對應(yīng)得出結(jié)果。
試劑盒組成
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1×小袋
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抗體包被的微孔板
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96孔板（12×8微孔板用鼠源AF單克隆抗體）
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6×小瓶
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AFM1標(biāo)準(zhǔn)品
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3.0mL/瓶，AFM1的濃度分別為0.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0, 100.0pg/mL(ppt)
溶解在穩(wěn)定脫脂乳中。
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1×小瓶
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HRP-AF偶聯(lián)物
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綠色蓋子
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15mL HRP-AF 添加防腐劑的緩沖溶液，可以直接使用
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1×小瓶
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底物試劑
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藍色蓋子
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15mL 穩(wěn)定的尿素過氧化氫物和TMB，可以直接使用
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1×小瓶
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終止液
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紅色蓋子
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15mL 酸性液體，可以直接使用
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1×小袋
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洗液
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PBST （PBS中加入0.05% 吐溫20），溶解在1L蒸餾水中，貯存在冰箱
中待用
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1×小瓶
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M1 脫脂乳
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白色蓋子
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15mL 脫脂乳用來制備乳酪提取物
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分析檢測操作步驟
1、使用前將試劑拿到室溫。
2、將裝試劑的小袋開封，根據(jù)待測的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的數(shù)量取出一定量的微孔。
3、將不使用的微孔重新放入小袋，封好口避免潮濕的空氣進入。（分析檢測完畢微孔支架將來可以繼續(xù)使用。）
4、每次都要使用新吸頭，吸取200μL 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加到兩個復(fù)孔里。
5、將板子裝入袋子中封口，避免水蒸氣揮發(fā)和紫外光的照射。
6、在室溫（19℃-25℃）下孵育2h。
7、將孔里的液體倒入合適的容器中，從洗瓶里吸取PBST洗板或用多道洗板洗孔，然后迅速棄掉洗液到合適的容器中，重復(fù)洗3次。在一層厚的吸水紙上拍板，去掉殘留的洗液。
8、每個孔中加入100μL的偶聯(lián)物（綠色蓋子）。
9、再次用袋子封好板子，室溫下孵育15min。
10、重復(fù)步驟7。
11、每個孔中加入100μL 酶反應(yīng)底物（TMB）孵育15-20min。
12、加入100μL的終止液終止反應(yīng)，板中顏色將會由藍色變?yōu)樽攸S色。
13、450nm 下讀取每個孔的吸光度值（OD），使用一個空白對照或者使用不同的630nm下濾光片。
可選擇的孵育操作
第一次孵育標(biāo)準(zhǔn)品和樣品階段，可以在4℃-6℃過夜，顯著的改善樣品為5ppt和更大濃度時0濃度抑制結(jié)合率。如果選擇這個步驟，接下來偶聯(lián)物和TMB的孵育可以在室溫下進行。
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孵育溫度
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ng/L
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過夜（4℃-6℃）, 結(jié)合率%
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室溫下2h, 結(jié)合率%
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0
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100.0
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100.0
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5
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83.8
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89.0
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10
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67.5
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80.1
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25
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37.4
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55.5
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50
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19.8
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36.3
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100
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12.5
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21.2
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檢測極限規(guī)定為2ppt（ng/L）, 2個標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0濃度檢測結(jié)果的平均OD值(n=18, CV<2%)。
結(jié)果分析
使用原有的OD值或?qū)嶒灚@得的OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線中AFM1濃度為0時OD值的百分比值建立劑量效應(yīng)曲線。通過在標(biāo)準(zhǔn)品曲線中添加新數(shù)值計算被測物質(zhì)中AFM1的濃度。
標(biāo)準(zhǔn)品和樣品獲得的平均吸光度值除以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時的吸光度值乘以100，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時為100%，其他標(biāo)準(zhǔn)品和樣品吸光度值都以這樣的形式表示。
標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值（或樣品）/標(biāo)準(zhǔn)品0濃度時吸光度值×100=%吸光度值
標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)值輸入到坐標(biāo)圖的坐標(biāo)系統(tǒng)中，計算AFM1的濃度ng/L。根據(jù)相應(yīng)的吸光度值每個樣品都能從坐標(biāo)曲線中讀出AFM1的濃度含量ng/L。
為了獲得樣品中AFM1的精確含量ng/L數(shù)據(jù)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取的濃度應(yīng)該乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。牛奶樣品乘以1，乳酪樣品乘以5。
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