1．概要

這個軟骨藻酸（ASP）ELISA檢測方法可以很敏感的定量檢測軟骨藻酸的含量。軟骨藻酸是和健忘性貝類毒素相關(guān)的一類海藻產(chǎn)生的水溶性毒素。試劑盒用于定量或定性檢測檢測水樣和貝類樣品中軟骨藻酸的含量。貝類樣品需要進行樣品前處理。如果需要可以用傳統(tǒng)的方法例如HPLC,GC/MS來證實。

2．安全說明

試劑盒中的標準溶液里含有少量的軟骨藻酸。底物中包含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液中含有稀硫酸。要避免

皮膚和粘膜與終止液接觸，如果不小心接觸了請馬上用水沖洗。

3．保存和穩(wěn)定性

試劑盒應(yīng)保存在2-8℃，不要冷凍。在使用之前要把試劑盒中的溶液回復(fù)到室溫（20-25℃）。有效期內(nèi)試劑盒中的試劑都可以使用。

4．原理

試劑盒的原理是直接競爭ELISA法，通過特異性抗體來識別軟骨藻酸。當樣品中含有軟骨藻酸時，樣品中的軟骨藻酸與軟骨藻酸酶結(jié)合物競爭結(jié)合溶液中的軟骨藻酸抗體。軟骨藻酸抗體與包被在微孔板上的羊抗鼠二抗結(jié)合。經(jīng)過一步洗滌加入底物溶液，產(chǎn)生有色反應(yīng)。產(chǎn)生的綠色的顏色深度與樣品中軟骨藻酸的含量成反比。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。用酶標儀在450nm處測定吸光度值。通過繪制標準曲線來計算樣品中軟骨藻酸的含量。

A．試劑盒組成：

1、包被二抗的微孔板（羊抗鼠）

2、標準（5種）0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/ml

3、1瓶對照（1ml）濃度3.5 ng/ml

4、軟骨藻酸抗體溶液（鼠抗軟骨藻酸）6ml

5、軟骨藻酸酶標記物6ml

6、樣品稀釋液（25ml）用于稀釋樣品

7、5x濃縮洗液100ml

8、顯色液（底物）TMB,16ml

9、終止液12ml

C.操作步驟

1、在對應(yīng)的微孔中加入50μL的標準、對照和樣品（推薦做2-3個重復(fù)）

2、每個測試孔都加入50 μL軟骨藻酸酶標記物溶液。

3、每個測試孔都加入50 μL軟骨藻酸抗體溶液，用封口膜把微孔板蓋上，輕輕的震蕩微孔板30秒使里面的液體混勻。不要使液體灑出。

4、在室溫下孵育60分鐘。

5、孵育完成后，把封口膜取掉，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL1X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。

6、每個測試孔加入100μL的顯色液（底物）。室溫孵育30分鐘，此步驟避免太陽光照射。

7、每個測試孔加入50μL終止液。

8、用酶標儀在450nm 下讀取每個孔的吸光度值（OD）（在加入終止液15分鐘內(nèi)完成）

D結(jié)果分析

結(jié)果分析可以利用商業(yè)ELISA分析軟件(4-parameters,Logit/Log)。手工計算可以先計算標準的吸光度值的平均值，然后計算每個標準的%B/B0（用其它標準的吸光度值除以零標準的吸光度值乘以100%）。以每個標準的%B/B0做Y軸，以每個標準的軟骨藻酸的濃度做X軸構(gòu)建標準曲線。通過利用標準曲線，把對照和樣品的%B/B0代入標準可以計算出樣品中軟骨藻酸的濃度。樣品中軟骨藻酸的含量小于0.5 ppb認為陰性。當樣品中軟骨藻酸的含量大于10.0 ppb要稀釋后再測定。