Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基

一、產(chǎn)品基本信息

二、產(chǎn)品簡介

Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基是埃澤思生物科技有限公司（Applied Cell^?）自主研發(fā)的一款營養(yǎng)成分更豐富，適用于大多數(shù)多能細(xì)胞系培養(yǎng)，且適用于 iPS 建系。該培養(yǎng)基適用于 Essential 8 系統(tǒng)和 mTeSR 培養(yǎng)系統(tǒng)，為無滋養(yǎng)層培養(yǎng)、無血清、化學(xué)成分明確?？蓱?yīng)用于干細(xì)胞傳代，內(nèi)含干細(xì)胞保護因子，防止     細(xì)胞的凋亡、分化，對細(xì)胞具有良好的保護作用。GMP 級別生產(chǎn)車間，嚴(yán)格執(zhí)行 cGMP 操作標(biāo)準(zhǔn)，各項指標(biāo)優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

三、產(chǎn)品特性

l 適用于 E8 系統(tǒng)和 mTeSR 系統(tǒng)培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞

l 成分明確，批間差小

l 無需滋養(yǎng)層細(xì)胞

l 營養(yǎng)更豐富，適用于大多數(shù)細(xì)胞系培養(yǎng)，且適用重編程過程細(xì)胞培養(yǎng)

四、產(chǎn)品內(nèi)容

五、相關(guān)產(chǎn)品

即用型基質(zhì)膠（Applied Cell^?: AC-1001007）

人多能干細(xì)胞消化液（Applied Cell^?: AC-1001008）

ES/iPS 細(xì)胞凍存液（Applied Cell^?: AC-1001012）

六、實驗準(zhǔn)備 Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基配制

1) 2-8℃解凍 Advance 人多能干細(xì)胞-添加劑，融化后上下晃動混勻，按實際用量進行分裝，立即使用或儲存于-20~ -80℃，避免反復(fù)凍融；

2) 按 1:4 的比例將 Advance 人多能干細(xì)胞-添加劑（100mL）加入到 Advance 人多能干細(xì)胞-基礎(chǔ)培養(yǎng)基(400mL)中，混合均勻即成為人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。混勻后的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基可在 2-8℃ 穩(wěn)定儲存 2-3 周，不建議使用配制已超過 3 周的人多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。

3) 實驗試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基實驗前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要 37℃水浴加熱。

七、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作) hPSC 細(xì)胞復(fù)蘇

1. 實驗操作步驟：

1.1. 基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出 6 孔板/12 孔板，每孔內(nèi)加入 1 mL/0.5 mL 即用型基質(zhì)膠

（AC-1001007），輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡 20min。如果暫時不用，可用Parafilm 封口后 2-8℃ 儲存，并于 1 周內(nèi)使用。

注意：①一支凍存的干細(xì)胞的數(shù)量在 1×10⁶cells/mL 左右，對應(yīng) 6 孔板 1 孔；②即用型基質(zhì)膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回 4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身， 影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2. 先將 2~3mL 的干細(xì)胞培養(yǎng)基加入 15mL 離心管中備用。

1.3. 解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入 37℃溫水中，快速搖動，使其在 1~2min 內(nèi)快速解凍； 注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

1.4. 離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細(xì)胞培養(yǎng)基的 15mL 離心管中，將 15mL 離心管置于低速離心機中配比平衡后，1200rpm 離心 3min；

1.5. 重懸：離心后棄上清加 1mL Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基對干細(xì)胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5 次左右。

1.6. 接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)包    被好的 6 孔板中，并補全每孔 2mL 培養(yǎng)體系。

1.7.培養(yǎng)：接種后的 6 孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團塊大小，呈4 個細(xì)胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于 37℃， 5% CO₂ 的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第 2 天觀察細(xì)胞貼壁情況；

1.8. 換液：從復(fù)蘇的時間開始每 24h 換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

八、hPSC 細(xì)胞傳代

2. 實驗具體操作步驟：

2.1. 清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入 1 mL PBS 緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS 緩沖液；

2.2. 消化：在 6 孔板中加入 2mL/孔人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于 37℃ 培養(yǎng)箱中 2~5 min；

注意：消化時間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，消化時間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗一般建議時間 2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克     隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3. 吹打：吸掉消化液后，加入 2mL Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底， 輕柔吹打 3~5 次，使皿底干細(xì)胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到 15mL 離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在 3~5 次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長     消化時間。

2.4. 離心：1200rpm 離心 3min；

2.5. 接種：棄上清，用干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打細(xì)胞 5-10 次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補全每孔 2mL 的培養(yǎng)體系。

注意：吹打細(xì)胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過 10 次，并且

2.6. 換液：從傳代的時間開始每 24h 換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

九、質(zhì)量控制