人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基

一、產(chǎn)品基本信息

二、產(chǎn)品簡介

人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基是埃澤思生物（Applied Cell^?）自主研發(fā)的一款無外源動物成分的人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基?？蓱糜谌四殠ЫM織來源的干細胞的原代分離、擴增與傳代培養(yǎng)，并保持其多向分化潛能。本產(chǎn)品內(nèi)毒素水平遠低于中國藥典標準，生產(chǎn)過程遵循 ISO9001 體系,并符合 GMP 指導原則。

人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基主要成分：氨基酸，維生素、無機鹽、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、     微量元素，細胞因子等。

三、產(chǎn)品特性

l 無外源動物蛋白成分，大大降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風險。

l 全程無血清生產(chǎn)，極大降低批次間差異。

l 可用于原代分離，且培養(yǎng)過程無需包被培養(yǎng)板。

l 擴增效率高，24h 左右增殖翻倍，節(jié)省培養(yǎng)時間。

l 內(nèi)毒素<0.06EU/ml，遠低于中國藥典水平

四、產(chǎn)品內(nèi)容

五、相關產(chǎn)品

無血清細胞凍存液（治療級）（Applied Cell^?: Cat. no.AC-1001006） 人臍帶間充質(zhì)干細胞（Applied Cell^?: Cat. no.AC-2001003）

細胞消化液（Applied Cell^?: Cat. no. AC-1001024）

六、實驗準備

人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基配制

1. 37℃快速解凍人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清添加劑，快速溶解時不易破壞添加劑中營養(yǎng)物質(zhì)，時間大致     為 10min。待添加劑融化后搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎培養(yǎng)基中，分裝后添加劑立即儲存于

-20℃至-80℃，避免反復凍融 。

2. 將添加劑以 10%比例加入到人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清基礎培養(yǎng)基中，混勻，即為人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基（AC-1001043PRF）。混合后培養(yǎng)基可在 2-8℃ 穩(wěn)定儲存 2-3 周，不建議使用已配制超過 3 周的培養(yǎng)基。

3. 人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基可直接應用于人類臍帶組織來源的干細胞的原代分離、擴增與傳代     培養(yǎng)。

4. 預先高溫高壓滅菌處理剪刀，鑷子等實驗器械。

5. 預先紫外滅菌超凈臺/安全柜等實驗環(huán)境。

七、操作方法(以下步驟皆應在無菌條件下操作)

1. 人臍帶間充質(zhì)干細胞原代分離（貼壁法）

臍帶簡介：臍帶包括臍帶血、華通氏膠、兩根動脈、一根靜脈，所有這些結構被臍帶上皮（內(nèi)襯膜）     包裹。臍帶是間充質(zhì)干細胞的主要來源，其中華通氏膠只含有間充質(zhì)干細胞一種干細胞，是最常用來分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的結構。而內(nèi)襯膜則含有至少兩種干細胞：間充質(zhì)干細胞和上皮干細胞，這兩種干細胞也是細胞治療的主要來源。

以下方法為從華通氏膠中分離高純度的間充質(zhì)干細胞詳細步驟：

1.1. 無菌收集長度約 10cm 的臍帶，迅速將臍帶放到含有人臍帶脂肪保存液（AC-1001016）的 50mL 離心管中。在 4℃條件下快速運到實驗室，在 4h 內(nèi)處理完成全部過程。

1.2. 將臍帶置于生物安全柜中冰盒里放置的直徑 10cm 培養(yǎng)皿中。用預冷的PBS 多次清洗臍帶，去除殘留的血液即止。以下分離組織塊的過程確保全程臍帶浸泡在預冷PBS 中保持濕潤。

1.3. 使用剪刀徑向剖開臍帶，將血管以及周圍的華通氏膠暴露出來。

1.4. 用解剖刀將華通氏膠與血管分離，用鑷子夾住血管，整條剝離，中間白色部分即華通氏膠（具體人    類臍帶結構參見圖 1） 。

1.5.用剪刀將華通氏膠剪成 0.5-1cm 見方的薄片組織塊，盡量不要太厚。最后剩余的臍帶上皮（內(nèi)襯膜）組織 棄除。

注意：組織塊盡量接近片狀，增大與培養(yǎng)皿接觸面積，提高細胞爬出率

1.6. 每個直徑 10cm 的培養(yǎng)皿中放置 10-15 個組織塊，加入 6mL 完全培養(yǎng)基。置于 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 不同原代分離體系初始組織塊數(shù)量以及細胞爬出率見表 1。

注意：①為促進組織塊貼壁，培養(yǎng)基不能加太多，否則組織塊容易漂起

②為促進組織塊貼壁，72 小時內(nèi)不能搖晃培養(yǎng)皿，72 小時第一次換液也是同理。

表 1 臍帶組織塊粘壁數(shù)據(jù)（平均數(shù)據(jù)）

1.3. 每 72 小時換液。一般 5-7 天可以看見貼壁組織塊附近有細胞爬出，12-15 天細胞匯合度達到 70% 以上，即可準備傳代。

1.4. 細胞傳代時，用槍頭吸掉組織塊以及原有培養(yǎng)基，加入 5mlPBS 清洗一次。每個直徑 10ml，的培養(yǎng)皿中加入 5ml 的細胞消化液（AC-1001024 ），搖勻覆蓋皿底，37℃恒溫箱 2-3min 或室溫3-5min 孵育。

1.5. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿底，輕輕敲打皿底，細胞呈細沙狀脫落，加入同體積完    全培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細胞完全脫落下來，將細胞懸液收集到 15mL 離心管中，300×g 離心 5min。

1.6. 用完全培養(yǎng)基重懸、計數(shù)，此時的細胞稱為P0 代。相關代次預期收獲細胞量請參考表 2。

1.7. 根據(jù)本公司統(tǒng)計數(shù)據(jù)，10cm 長的臍帶，約可以收獲 1.24×10⁷ 個P0 代細胞，一根臍帶長度大約 20cm，約可以收獲 2.5×10⁷ 個P0 代細胞。

1.8. 根據(jù)本公司檢測，按 1:8 傳代，細胞形態(tài)在P10 代內(nèi)不發(fā)生變化。P10 代以上細胞沒有實際應用意義，暫不檢測。

1.9. 臍帶兩端的組織原代分離效率有較大差異，近胎盤端分離效率要高于近胎兒端 10-30%。

表 2 10cm 長的臍帶P0-P5 代預計收獲細胞數(shù)量（1:8 傳代）

2. 人臍帶間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)

2.1. 在顯微鏡下觀察細胞，細胞匯合度達到 90%，即可準備傳代;

2.2. 吸掉培養(yǎng)瓶/皿中的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗一次，加入適量的細胞消化液（AC-1001024）覆蓋瓶/ 皿底，37℃恒溫箱 2-3min 或室溫 3-5min 孵育。

2.3. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離瓶/皿底，輕輕敲打瓶/皿底，細胞呈細沙狀脫落，加入等    倍體積的完全培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細胞脫落下來，并輕輕吹打成單細胞，將細胞懸液收集    到適當?shù)碾x心管中，室溫 300×g 離心 5min。

2.4. 棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基，重懸細胞，按照比例進行傳代或計數(shù)后按照 1.1-1.45×104 個/cm2 密度進行接種。均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于 37℃，5%CO2 條件下培養(yǎng)。相關數(shù)據(jù)請見表 3。

注意：細胞規(guī)模生產(chǎn)建議 1:5-1:8 傳代，一般 72 小時可以達到 90%以上匯合度。

表 3 不同體系建議細胞接種數(shù)量及加液量

3. 人臍帶間充質(zhì)干細胞凍存

       3.1. 同步驟 2.1；

       3.2. 同步驟 2.2；

       3.3. 同步驟 2.3；

3.4. 棄上清，用 4℃保存的無血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）重懸細胞，取部分細胞計數(shù)。

注意：無血清細胞凍存液即拿即用，用完之后盡快放回 4℃冰箱，以防室溫放置太久，影響質(zhì)量。

3.5. 計數(shù)后用無血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）調(diào)節(jié)細胞密度至建議凍存密度   1-5×10⁶ 個/mL，每支凍存管（需提前做好標記）分裝 1.5-2mL，直接放入-80℃冰箱快速凍存。

3.6. -80℃放置過夜后轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。

4. 人臍帶間充質(zhì)干細胞復蘇

4.1. 從液氮中取出凍存的hUMSC，37℃水浴快速融解。

4.2.在生物安全柜或超凈臺中，先在 15mL 離心管中加入 5 mL 37℃預熱的完全培養(yǎng)基，將解凍后的細胞懸液緩慢滴加到離心管中。

4.3.300×g 離心 3min，吸掉上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞至建議接種濃度（參考表 3）。

4.5.將細胞懸液均勻滴加到培養(yǎng)瓶/皿中，水平十字振動培養(yǎng)瓶/皿使細胞均勻。置于 37℃，5% CO2 條件下培養(yǎng) 24 小時后觀察細胞復蘇狀態(tài)。

4.6.細胞無異常即可同時更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4.7.初次換液后每 48-72 小時更換培養(yǎng)液直至傳代。

八、質(zhì)量控制